| Назва: | Агробактеріальна трансформація ячменю |
| Тип: | Реферати |
| Мова: | Українська |
| Розмiр: | 9,7 KB |
| Скачувань: | 39 |
Агробактеріальна трансформація ячменю
Агробактеріальний спосіб доставки ДНК має явні переваги перед іншими найпоширенішими методами трансформації рослин (балістичним, електропорації, мікроін'єкції). Цей метод дозволяє вводити в реципієнт порівняно велику генетичну конструкцію, приводить до мінімальних порушень у кодуючій послідовності гена, що переноситься, забезпечує включення в геном реципієнта обмежене число копій чужорідного гена, і нарешті, не вимагає застосування спеціального устаткування.
Агробактеріальний механізм переносу генів застосовують головним чином до дводольних рослин. Використання агробактерії для трансформації однодольних рослин донедавна було обмежено. Існує природний бар'єр, що перешкоджає взаємодії агробактерії й однодольних рослин. Передбачається, що це пов'язане з тим, що однодольні рослини, на противагу дводольним, або не виділяють зовсім, або виділяють із поранених тканин занадто мало специфічних фенольних з'єднань типу ацетосірінгона [1]. Відомо, що ці з'єднання активують гени вірулентності (vіr-гени) Ті-плазміди агробактерії. Було висловлене припущення про можливості підвищення ефективності агробактеріальної трансформації за рахунок додавання ацетосірінгона в суміш для спільного культивування препарату рослинних тканин і суспензії агробактерії. У такий спосіб удалося здійснити агробактеріальну трансформацію ряду злакових культур − рису, кукурудзи, ячменя й пшениці [2-6].
Ціль даної роботи - оптимізувати і по можливості спростити метод агробактеріальної трансформації однодольних рослин на прикладі ячменя.
УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ
За основу генетичної агробактеріальної трансформації ячменя була взята методика спільного культивування рослинних тканин (експлантів) і агробактерії [7]
Реципієнтна система. Як реципієнтів використали насіння ячменя (Hordeum vulgare L.) сорт Scarlett, надані Інноваційним центром селекції й виробництва пивоварного ячменя «Хордес» при Міністерстві сільського господарства РФ.
Бактеріальний матеріал. Для трансформації використали штам Agrobacterium tuimfaciens 3850/рВАЗ, люб'язно наданий професором Б. А. Левенко (Інститут фізіології рослин і генетики НАН України). Плазміда рВАЗ містить bar-ген (bialaphos resistance), що визначає стійкість до фосфінотріцину, активному діючому початку гербіциду біалафос (комерційна назва гербіциду - "Basta") [8].
Процедура трансформації.Агробактерії протягом доби культивували в рідкому середовищі LB з додаванням 50 мг/л канаміцину й 50 мг/л рифампіцину. Культивування проводили на качалці (150-200 об/хв) у темряві при температурі 28°.
Екстракт із рослин тютюну одержували з вирослих у стерильних умовах рослин у такий спосіб: лисття дрібно нарізали, поміщали в колбу (50 мл) з рідким середовищем МС без гормонів і проводили інкубацію протягом 2 год на качалці із круговим обертанням.
Розчин ацетосірінгону стерилізували фільтруванням через фільтри Millipor (розмір пop 0,2 мкм).
Насіння ячменю стерилізували в хлормісному розчині («Білизна», Росія) протягом 10 хв, що стерилізуючий розчин видаляли й насіння ретельно промивали стерильною дистильованою водою (не менш 3 разів) протягом 30 хв. Після стерилізації, зерна розрізали поперек скальпелем.
Безпосередньо перед проведенням трансформації бактеріальну суспензію й екстракт із рослин тютюну змішували в рівних співвідношеннях.
Частини зерен , що містять зародки, поміщали в агробактеріальну суспензію з додаванням екстракту з рослин тютюну або ацетосірінгону (50 мкМ) і витримували в умовах вакууму кГс/див2) 1-2 год. Цей прийом використовується для заповнення бактеріальною суспензією міжклітинного простору препарату зерен.
Спільне культивування агробактерій і насінь проводили на качалці (200 об/хв) протягом 1-2 діб у темряві при температурі 28°.
Після інокуляції насіння переносили на стерильний фільтрувальний папір або тканину для видалення суспензії агробактерій. Потім протягом 7-10 днів їх пророщували у світловій камері на середовищі МС (1/2 концентрації
мінеральних солей, без гормонів) з додаванням 500 мг/л клафорану (Roussel Uclaf, Франція) для інгібування подальшого росту агробактерій й 50 мг/л канаміцину («Ферейн», Росія) як селективний агент. Культивування рослинного матеріалу проводили в наступних умовах: 24-25°; освітленість 5 клк; тривалість світлового дня 16 год.
Зелені проростки ячменя висаджували в ґрунт і вирощували в теплиці при температурі 20° і тривалості світлового дня 14 ч.
Через 10-15 днів рослини обприскували розчином гербіциду "Basta" (8 мг/л). Рослини, стійкі до гербіциду, мали зелене забарвлення й продовжували формувати вегетативні органи.
ПЦР-аналіз. Матеріал, отриманий з рослин, що виявили стійкість до гербіциду, використали для виділення геномної ДНК по методу Moller et al [9], що потім аналізували методом ПЦР.
Для ПЦР використали пару праймерів для гена bar (З AT «Синтол», Москва):
bаr-1 плюс:
5'-TGC-ACC-ATC-GTC-AAC-CAC-TA-3';
bar-2 мінус:
5'-АС A-GCG-ACC-ACG-CTC-TTG-AA-3'.
Агробактеріальний спосіб доставки ДНК має явні переваги перед іншими найпоширенішими методами трансформації рослин (балістичним, електропорації, мікроін'єкції). Цей метод дозволяє вводити в реципієнт порівняно велику генетичну конструкцію, приводить до мінімальних порушень у кодуючій послідовності гена, що переноситься, забезпечує включення в геном реципієнта обмежене число копій чужорідного гена, і нарешті, не вимагає застосування спеціального устаткування.
Агробактеріальний механізм переносу генів застосовують головним чином до дводольних рослин. Використання агробактерії для трансформації однодольних рослин донедавна було обмежено. Існує природний бар'єр, що перешкоджає взаємодії агробактерії й однодольних рослин. Передбачається, що це пов'язане з тим, що однодольні рослини, на противагу дводольним, або не виділяють зовсім, або виділяють із поранених тканин занадто мало специфічних фенольних з'єднань типу ацетосірінгона [1]. Відомо, що ці з'єднання активують гени вірулентності (vіr-гени) Ті-плазміди агробактерії. Було висловлене припущення про можливості підвищення ефективності агробактеріальної трансформації за рахунок додавання ацетосірінгона в суміш для спільного культивування препарату рослинних тканин і суспензії агробактерії. У такий спосіб удалося здійснити агробактеріальну трансформацію ряду злакових культур − рису, кукурудзи, ячменя й пшениці [2-6].
Ціль даної роботи - оптимізувати і по можливості спростити метод агробактеріальної трансформації однодольних рослин на прикладі ячменя.
УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ
За основу генетичної агробактеріальної трансформації ячменя була взята методика спільного культивування рослинних тканин (експлантів) і агробактерії [7]
Реципієнтна система. Як реципієнтів використали насіння ячменя (Hordeum vulgare L.) сорт Scarlett, надані Інноваційним центром селекції й виробництва пивоварного ячменя «Хордес» при Міністерстві сільського господарства РФ.
Бактеріальний матеріал. Для трансформації використали штам Agrobacterium tuimfaciens 3850/рВАЗ, люб'язно наданий професором Б. А. Левенко (Інститут фізіології рослин і генетики НАН України). Плазміда рВАЗ містить bar-ген (bialaphos resistance), що визначає стійкість до фосфінотріцину, активному діючому початку гербіциду біалафос (комерційна назва гербіциду - "Basta") [8].
Процедура трансформації.Агробактерії протягом доби культивували в рідкому середовищі LB з додаванням 50 мг/л канаміцину й 50 мг/л рифампіцину. Культивування проводили на качалці (150-200 об/хв) у темряві при температурі 28°.
Екстракт із рослин тютюну одержували з вирослих у стерильних умовах рослин у такий спосіб: лисття дрібно нарізали, поміщали в колбу (50 мл) з рідким середовищем МС без гормонів і проводили інкубацію протягом 2 год на качалці із круговим обертанням.
Розчин ацетосірінгону стерилізували фільтруванням через фільтри Millipor (розмір пop 0,2 мкм).
Насіння ячменю стерилізували в хлормісному розчині («Білизна», Росія) протягом 10 хв, що стерилізуючий розчин видаляли й насіння ретельно промивали стерильною дистильованою водою (не менш 3 разів) протягом 30 хв. Після стерилізації, зерна розрізали поперек скальпелем.
Безпосередньо перед проведенням трансформації бактеріальну суспензію й екстракт із рослин тютюну змішували в рівних співвідношеннях.
Частини зерен , що містять зародки, поміщали в агробактеріальну суспензію з додаванням екстракту з рослин тютюну або ацетосірінгону (50 мкМ) і витримували в умовах вакууму кГс/див2) 1-2 год. Цей прийом використовується для заповнення бактеріальною суспензією міжклітинного простору препарату зерен.
Спільне культивування агробактерій і насінь проводили на качалці (200 об/хв) протягом 1-2 діб у темряві при температурі 28°.
Після інокуляції насіння переносили на стерильний фільтрувальний папір або тканину для видалення суспензії агробактерій. Потім протягом 7-10 днів їх пророщували у світловій камері на середовищі МС (1/2 концентрації
мінеральних солей, без гормонів) з додаванням 500 мг/л клафорану (Roussel Uclaf, Франція) для інгібування подальшого росту агробактерій й 50 мг/л канаміцину («Ферейн», Росія) як селективний агент. Культивування рослинного матеріалу проводили в наступних умовах: 24-25°; освітленість 5 клк; тривалість світлового дня 16 год.
Зелені проростки ячменя висаджували в ґрунт і вирощували в теплиці при температурі 20° і тривалості світлового дня 14 ч.
Через 10-15 днів рослини обприскували розчином гербіциду "Basta" (8 мг/л). Рослини, стійкі до гербіциду, мали зелене забарвлення й продовжували формувати вегетативні органи.
ПЦР-аналіз. Матеріал, отриманий з рослин, що виявили стійкість до гербіциду, використали для виділення геномної ДНК по методу Moller et al [9], що потім аналізували методом ПЦР.
Для ПЦР використали пару праймерів для гена bar (З AT «Синтол», Москва):
bаr-1 плюс:
5'-TGC-ACC-ATC-GTC-AAC-CAC-TA-3';
bar-2 мінус:
5'-АС A-GCG-ACC-ACG-CTC-TTG-AA-3'.
