| Назва: | Агробактеріальна трансформація ячменю |
| Тип: | Реферати |
| Мова: | Українська |
| Розмiр: | 9,7 KB |
| Скачувань: | 8 |
Ампліфікацію проводили в програмувальному термоциклері МС2 (ЗАТ «Днк-технологія», Москва).
Продукти реакції з реакційної суміші (10 мкл) розділяли електрофорезом в 2%-ном агаризованому гелі із бромистим етидієм у ТВЄ-буфері. Для визначення довжини фрагментів використовували маркер МЗ (123 bp DNA Ladder) Gibco BRL, США. Як негативний контроль у реакційну суміш замість досліджуваної ДНК додавали 5 мкл води. Як позитивний контроль використовували плазмідну ДНК зі штаму Agrobacterium tumefaciens 3850/рВАЗ. ПЦР-анализ проводили в трикратній повторності для кожного зразка геномної ДНК зародків ячменя.
РЕЗУЛЬТАТИ і ОБГОВОРЕННЯ
За останні роки був виконаний ряд робіт із трансформації ячменя, у тому числі й агробактеріальним методом [10, 11]. У більшості випадків як реципієнти були використані незрілі зародки сорту Golden Promise або отриманий з них морфогенний каллус. Згодом для одержання трансформованих рослин необхідно було регенерувати рослини з каллуса, що неминуче пов'язане із тривалим культивуванням in vitro, використанням фітогормонів і ризиком прояву сомаклональної мінливості.
Довгий час вважалося, що на процес трансформації істотний вплив робить ушкодження потенційного хазяїна. Всі спроби провести трансформацію однодольних рослин через неушкоджений епідерміс довгий час залишалися безуспішними [12]. В 1987 р. була проведена успішна агробактеріальна трансформація насінь, що проростають, Arabidopsis thaliana [13]. Одним з переваг пропонованого в даній роботі методу є відсутність необхідності використовувати ушкоджені рослини реципієнта. Опис методу, а також вплив на нього ряду фізичних факторів і хімічних агентів наведені в наступних розділах.
Тривалість сокультивування агробактерій і насінь. За результатами наших попередніх досвідів і за літературним даними, оптимальний час трансформації становить не менш доби [14]. Можливо, саме такий час необхідно для проникнення агробактерій крізь клітинну стінку однодольних рослин, якщо цей процес відбувається шляхом ферментативного розчинення клітинної стінки [15]. При меншому часі експозиції поява трансформованих рослин у наших досвідах не спостерігалась. Сокультивування протягом більше 2 діб приводить до різкого збільшення концентрації бактеріальних клітин у суспензії і їхньому згубному впливі на насіння. Так, якщо після 24 ч інкубації насінь у суспензії агробактерій сходять 70 % насінь ячменя, то через 2 діб-55 %, а через 3 діб- 15 % (усереднені показники, отримані в даній роботі).
Використання як факторів, що стимулюють трансформацію, ацетосірінгону та екстракту з рослин тютюну. Деякі культури для проведення успішної трансформації, вимагають особливих умов сокультивування. Так наприклад, для підвищення ефективності трансформації цукрового очерету в суспензію, що містить A. tutnefaciens й експланти, додавали аскорбінову кислоту (0,09 мкМ) і цистеін (0,33 мкМ) [16]. Для успішної агробактеріальної трансформації однодольних рослин звичайно використовують ацетосірінгон [17-19].
Екстракт із рослин тютюну на практиці широко й з успіхом застосовують при проведенні агробактеріальної трансформації самий різних видів рослин й експлантів. Відомо, що механічно ушкоджені й рослинні клітини, що активно діляться, дводольних рослин утворюють речовини, індукуючі vіr-гени [20]. Цілком можливо, що екстракт тютюну є природним джерелом подібних речовин.
При обробці насінь ячменю суспензією A. tumefaciens, що містить ацетосірінгон або екстракт тютюну, нами отримані стійкі до канаміцину
рослини. Зелені регенеранти висаджували в ґрунт. Через 10-15 днів культивування рослини обробляли гербіцидом "Basta" у концентрації 8 мг/л. Рослини, стійкі до гербіциду, мали зелене забарвлення й формували вегетативні органи. У частини з них ПЦР-анализ підтвердив включення в ДНК рослин гена bar (малюнок).
Без використання ацетосірінгону або тютюнового екстракту одержати трансформовані рослини не вдалося (контрольний варіант). Для здійснення трансформації виявилася ефективної штучна активація генів вірулентності бактерій.
Хоча ацетосірінгон й інгібує деякою мірою проростання насінь ячменя, однак частота трансформації рослин ячменя в результаті даного експерименту становить 2%. Цей показник для однодольних рослин відповідає середньому рівню й тому є цілком прийнятним. Слід зазначити, що при використанні екстракту тютюну (без ацетосірінгону) частота трансформації трохи вище (2,7%).
Застосування вакуумної обробки. Застосування вакуумної обробки вперше було здійснено при трансформації Arabidopsis thaliana [21 ]. Цей спосіб активно використовується для одержання трансформованих рослин однодольних інших видів [14, 22]. Для підвищення ефективності трансформації насіння витримували в агробактеріальної суспензії (з додаванням екстракту тютюну) в умовах вакууму (-1 кГс/див ) протягом 1 год. Ціль такої обробки полягала в полегшенні проникнення клітин агробактерій у внутрішні тканини зерновки.
Продукти реакції з реакційної суміші (10 мкл) розділяли електрофорезом в 2%-ном агаризованому гелі із бромистим етидієм у ТВЄ-буфері. Для визначення довжини фрагментів використовували маркер МЗ (123 bp DNA Ladder) Gibco BRL, США. Як негативний контроль у реакційну суміш замість досліджуваної ДНК додавали 5 мкл води. Як позитивний контроль використовували плазмідну ДНК зі штаму Agrobacterium tumefaciens 3850/рВАЗ. ПЦР-анализ проводили в трикратній повторності для кожного зразка геномної ДНК зародків ячменя.
РЕЗУЛЬТАТИ і ОБГОВОРЕННЯ
За останні роки був виконаний ряд робіт із трансформації ячменя, у тому числі й агробактеріальним методом [10, 11]. У більшості випадків як реципієнти були використані незрілі зародки сорту Golden Promise або отриманий з них морфогенний каллус. Згодом для одержання трансформованих рослин необхідно було регенерувати рослини з каллуса, що неминуче пов'язане із тривалим культивуванням in vitro, використанням фітогормонів і ризиком прояву сомаклональної мінливості.
Довгий час вважалося, що на процес трансформації істотний вплив робить ушкодження потенційного хазяїна. Всі спроби провести трансформацію однодольних рослин через неушкоджений епідерміс довгий час залишалися безуспішними [12]. В 1987 р. була проведена успішна агробактеріальна трансформація насінь, що проростають, Arabidopsis thaliana [13]. Одним з переваг пропонованого в даній роботі методу є відсутність необхідності використовувати ушкоджені рослини реципієнта. Опис методу, а також вплив на нього ряду фізичних факторів і хімічних агентів наведені в наступних розділах.
Тривалість сокультивування агробактерій і насінь. За результатами наших попередніх досвідів і за літературним даними, оптимальний час трансформації становить не менш доби [14]. Можливо, саме такий час необхідно для проникнення агробактерій крізь клітинну стінку однодольних рослин, якщо цей процес відбувається шляхом ферментативного розчинення клітинної стінки [15]. При меншому часі експозиції поява трансформованих рослин у наших досвідах не спостерігалась. Сокультивування протягом більше 2 діб приводить до різкого збільшення концентрації бактеріальних клітин у суспензії і їхньому згубному впливі на насіння. Так, якщо після 24 ч інкубації насінь у суспензії агробактерій сходять 70 % насінь ячменя, то через 2 діб-55 %, а через 3 діб- 15 % (усереднені показники, отримані в даній роботі).
Використання як факторів, що стимулюють трансформацію, ацетосірінгону та екстракту з рослин тютюну. Деякі культури для проведення успішної трансформації, вимагають особливих умов сокультивування. Так наприклад, для підвищення ефективності трансформації цукрового очерету в суспензію, що містить A. tutnefaciens й експланти, додавали аскорбінову кислоту (0,09 мкМ) і цистеін (0,33 мкМ) [16]. Для успішної агробактеріальної трансформації однодольних рослин звичайно використовують ацетосірінгон [17-19].
Екстракт із рослин тютюну на практиці широко й з успіхом застосовують при проведенні агробактеріальної трансформації самий різних видів рослин й експлантів. Відомо, що механічно ушкоджені й рослинні клітини, що активно діляться, дводольних рослин утворюють речовини, індукуючі vіr-гени [20]. Цілком можливо, що екстракт тютюну є природним джерелом подібних речовин.
При обробці насінь ячменю суспензією A. tumefaciens, що містить ацетосірінгон або екстракт тютюну, нами отримані стійкі до канаміцину
рослини. Зелені регенеранти висаджували в ґрунт. Через 10-15 днів культивування рослини обробляли гербіцидом "Basta" у концентрації 8 мг/л. Рослини, стійкі до гербіциду, мали зелене забарвлення й формували вегетативні органи. У частини з них ПЦР-анализ підтвердив включення в ДНК рослин гена bar (малюнок).
Без використання ацетосірінгону або тютюнового екстракту одержати трансформовані рослини не вдалося (контрольний варіант). Для здійснення трансформації виявилася ефективної штучна активація генів вірулентності бактерій.
Хоча ацетосірінгон й інгібує деякою мірою проростання насінь ячменя, однак частота трансформації рослин ячменя в результаті даного експерименту становить 2%. Цей показник для однодольних рослин відповідає середньому рівню й тому є цілком прийнятним. Слід зазначити, що при використанні екстракту тютюну (без ацетосірінгону) частота трансформації трохи вище (2,7%).
Застосування вакуумної обробки. Застосування вакуумної обробки вперше було здійснено при трансформації Arabidopsis thaliana [21 ]. Цей спосіб активно використовується для одержання трансформованих рослин однодольних інших видів [14, 22]. Для підвищення ефективності трансформації насіння витримували в агробактеріальної суспензії (з додаванням екстракту тютюну) в умовах вакууму (-1 кГс/див ) протягом 1 год. Ціль такої обробки полягала в полегшенні проникнення клітин агробактерій у внутрішні тканини зерновки.